研究活動

論文紹介

概要

A型およびB型インフルエンザウイルスは、8本に分節化したRNAをゲノムとして持っています。それぞれのRNA分節は核タンパク質およびRNA依存的RNAポリメラーゼと結合し、ウイルス粒子内でRNPと呼ばれる棒状の構造物を形成しています。感染細胞から出芽する際、子孫ウイルスが感染性を持つためには、ウイルス粒子内に8種類すべてのRNPを取り込む必要があります。しかし、8種類8本のRNPがどのようにウイルス粒子内に取り込まれているのか、詳細な機構はわかっていません。

これまでに、A型実験室株では、ウイルス粒子内に8本のRNPが選択的に取り込まれることが示されています。しかし、臨床分離株やB型ウイルス粒子内にRNPがどのように取り込まれるかは明らかになっていません。

本研究では、透過型電子顕微鏡を用いて電子線トモグラフィーを行うことで、A型およびB型ウイルスの実験室株と臨床分離株のウイルス粒子内に取り込まれたRNPの配置と本数を解析しました。

その結果、A型およびB型ウイルスは、株に依らず、一部のウイルス粒子が7本以下のRNPを取り込むものの、ほとんどのウイルス粒子が8本のRNPを取り込むことが明らかになりました。

本研究で得られた知見は、株や型に依らないインフルエンザウイルスの増殖メカニズムを紐解く重要な手がかりとなることが期待されます。

電子線トモグラフィー法による各ウイルス粒子の立体再構築
インフルエンザウイルスを様々な角度から電子顕微鏡で撮影し(A)、得られた像をコンピューターで処理することで(B)、一つのインフルエンザウイルス粒子全体を再構築することができる(C)。この手法を用いることで、ウイルス粒子内に取り込まれたRNPの配置と本数を知ることができる。

概要

宿主細胞の核内で複製されたインフルエンザウイルスゲノムが、核内で輸送されるのに関わる宿主のタンパク質としてCLUH(clustered mitochondria protein homolog)を同定しました。

ウイルスゲノムの複製とウイルスゲノムの核外輸送複合体の形成は、核内で起きると報告されてきました。ところが、ウイルスの増殖に必要な「複製」と「複合体形成」が核内の同じ場所で起きているかどうかは不明でした。本研究において、新規に複製されたウイルスゲノムは、核内を移動した後に、核外輸送複合体が形成される領域へ到達することが明らかとなりました。

CLUHは通常細胞質に存在しますが、ウイルス感染により核内へと移動し、複製されたウイルスゲノムを運ぶ役割に関わることがわかりました。本研究成果は、ウイルス感染細胞の核内でのみ見られる現象を明らかにしたものであり、特異的なインフルエンザ治療薬開発のターゲットになることが期待されます。

概要

新規インフルエンザウイルス蛋白質PA-Xは、PAをコードするmRNAからPA蛋白質が翻訳される過程でリボソーマルフレームシフトが起こり発現します。そのため、PA-XはN末端にPAとの共通領域を、C末端にPA-X特異的な領域をもちます。

PA-XはN末端にあるエンドヌクレアーゼ活性部位を介しmRNAの発現抑制を引き起こし、宿主およびウイルス蛋白質の発現を抑制します。この活性によりPA-Xは宿主の抗ウイルス応答に必須なIFN-βの発現や抗ウイルス抗体の産出を抑制し、宿主によるウイルスクリアランスを阻害します。

本研究では、N末端のエンドヌクレアーゼのみならず、C末端の6つの塩基性アミノ酸がPA-Xの発現抑制活性に重要であることを明らかにしました。本研究で得られたこれらの知見は、ウイルス蛋白質の作用機序を明らかにするための重要な手がかりとなることが期待されます。

概要

インフルエンザウイルス本来の病原性を保ち、かつ挿入した蛍光たんぱく質の発現をほぼ完全に維持できるウイルス株「Color-flu」を樹立することに成功しました。Color-fluは、蛍光たんぱく質(eCFP, eGFP, Venus, mCherry)を利用して感染細胞を光らせるので、生体内でウイルス感染が広がる様子や宿主応答をさまざまな手法で画像分析することが可能になります。本研究では、2光子レーザー顕微鏡を用いて、マウスの肺組織におけるウイルス感染細胞とマクロファージのタイムラプス撮影に初めて成功し、インフルエンザウイルスの感染により起こる免疫応答を観察することができました。さらに、Venusを発現する高病原性鳥インフルエンザウイルス(H5N1)を作製し、マウスの肺での感染の広がり方を高病原性ウイルスとインフルエンザウイルス(PR8株)とで比較することができました。Color-fluは、ウイルス病原性の解明、ウイルスに対する生体防御や気道炎症のメカニズムの解明に役立ち、さらにはワクチンや薬剤開発まで幅広く利用されることが期待されます。

概要

肺炎球菌は、肺炎や中耳炎、髄膜炎などの原因となる病原体です。また肺炎球菌は、インフルエンザ罹患後の細菌性二次感染を引き起こすことが知られておりますが、インフルエンザウイルスと肺炎球菌の両方を同時に防御できるワクチンは開発されておりませんでした。

そこで今回私たちは、インフルエンザウイルスを人工合成するリバースジェネティクス法を用いて、肺炎球菌の抗原タンパク質を発現する非増殖型組み換えインフルエンザウイルスを作製いたしました(HA-KO/PspAウイルス)。

この組み換えウイルスを経鼻投与されたマウスでは、呼吸器においてインフルエンザウイルスだけでなく肺炎球菌抗原に対する抗体も誘導されることが確認され、致死的な肺炎球菌感染や、鼻腔内の菌の定着も予防できることが明らかとなりました。

今回開発された組み換えウイルスは、様々な呼吸器感染症に対するワクチンのプラットホームになることが期待されます。

概要

2013年3月下旬以降、中国において、H7N9鳥インフルエンザウイルス(H7N9ウイルス)のヒトへの感染例が報告されており、死亡例や重症化した例が多数確認されています。一般に、H7N9ウイルスは、季節性のインフルエンザウイルスとは異なり、簡単にはヒトへの感染を起こしません。そこで我々は、中国の患者から分離されたH7N9ウイルスに関する性状解析を行いました。その結果、本ウイルスが哺乳類でよく増殖すること、フェレットの間で限定的ながらも空気伝播することが分かりました(図1)。また、H7N9ウイルスに対して、ヒトが免疫を持たないことや、現在臨床で用いられているノイラミニダーゼ阻害剤の効果が低いことが明らかとなりました(図2)。従って、H7N9ウイルスによるパンデミックが起これば、甚大な被害をもたらす可能性が高いと予想されます。今回明らかにされたH7N9ウイルスの性状は、治療方法やワクチン開発、新規抗ウイルス薬の開発を含めた今後の対策を考える上で、重要な知見となります。

図1 フェレットを用いたウイルス伝播実験
図1 フェレットを用いたウイルス伝播実験
鳥から分離されたH7N9ウイルスと今回ヒトから分離されたH7N9ウイルスを用いて、フェレットにおけるウイルスの伝播実験を行いました。鳥から分離されたH7N9ウイルスはフェレット間での伝播は見られませんでしたが、ヒトから分離されたH7N9ウイルスはフェレット3匹中1匹においてウイルスの伝播が確認されました。
図2 ヒトから分離されたH7N9鳥インフルエンザウイルスに対する抗インフルエンザ薬の効果
図2 ヒトから分離されたH7N9鳥インフルエンザウイルスに対する抗インフルエンザ薬の効果
H7N9ウイルス、および、2009年のH1N1パンデミックウイルス(pdm09ウイルス)をそれぞれマウスに感染させ、2時間後に抗インフルエンザ薬を投与し、感染3日目および6日目のマウスの肺におけるウイルス量を測定しました。H7N9ウイルスは、既存のノイラミニダーゼ阻害薬であるオセルタミビル、ザナミビル、およびラニナミビルに対して低い感受性を示しましたが、未認可のRNAポリメラーゼ阻害剤であるファビピラビルには感受性を示しました。

概要

インフルエンザウイルスのゲノムRNAは8本に分節化しています。それぞれのRNA分節は、ウイルスの核たんぱく質とウイルスRNA依存的RNAポリメラーゼと共にリボ核酸たんぱく質複合体 (RNP) を形成し、ウイルス粒子内に取り込まれています (左図)。

これまで、RNPがどのような方向でウイルス粒子内に取り込まれているかは判っていませんでした。本研究では、様々な電子顕微鏡法を用いた観察によって、ウイルス粒子内には異なる方向をとったRNPが混在していることを明らかにしました (右図)。

これによって、インフルエンザウイルスの今まで知られていなかったゲノム取り込み機構の一端が明らかになったと言えます。

概要

我々は、呼吸器粘膜において抗原特異的抗体を誘導できるPB2欠損非増殖型インフルエンザウイルスを作出し、その有効性を明らかにしてきました(Ozawa et al. JGV 2011, Victor et al. JV 2012)。このウイルスはPB2を欠損させた部位に外来遺伝子を搭載することで多価ワクチンへの応用が期待できます。そこで、欠損部位に、2009年にパンデミックを起こしたウイルス(pdmH1N1)およびH5N1高病原性鳥インフルエンザウイルスのHAをそれぞれ搭載したウイルスを作出し、二価ワクチンとしての効果を検証しました。

その結果、今回開発した二価ワクチンを投与したマウスでは、抗原性の異なる2つのウイルス株に対する特異的抗体が誘導されており、さらに、致死量の野生型ウイルスを感染させても100%生残しました。

以上の結果から、 PB2欠損非増殖型インフルエンザウイルスは多価ワクチンの新たなプラットフォームになることが示唆されました。

概要

宿主細胞に侵入後、エボラウイルスがどのような宿主蛋白質を利用してウイルスゲノムの転写・複製を行うのかは殆ど分かっていませんでした。そこで私たちは、ウイルスポリメラーゼ蛋白質(EBOL)と相互作用することでウイルスゲノムの転写・複製に関わる宿主蛋白質を探索し、DNA topoisomerase 1 (TOP1)を同定しました。本研究により、通常は核内に局在するTOP1が、ウイルスゲノムの転写・複製の場である細胞質でEBOLと相互作用すること、また、TOP1が持つ核酸切断能および核酸再結合能がウイルスゲノムの転写・複製効率に重要である事を明らかにしました。

A) TOP1抑制細胞におけるウイルスポリメラーゼ活性。比較対象としてインフルエンザウイルスのポリメラーゼ活性を測定した。
B) EBOLとTOP1の細胞内局在。細胞質で共局在する。緑はEBOL、赤はTOP1を表す。

概要

A型インフルエンザウイルスのゲノムRNAは8本に分節化されています。これまで、8種類のRNA分節に合計10種類のウイルス蛋白質がコードされていると考えられてきましたが、近年、PB1-F2やPB1-N40、PA-Xなど、新たなウイルス蛋白質が見つかっています。そこで私たちはPA遺伝子分節に着目し、新たなウイルス蛋白質の探索を行いました。その結果、PA遺伝子分節に、新たなウイルス蛋白質「PA-N155」と「PA-N182」がコードされていること、さらにPA‐N155 とPA-N182がウイルス増殖やマウスにおける病原性に関与することを明らかにしました。

概要

2009年インフルエンザ(以下、A(H1N1)pdm09)ウイルスによるパンデミックが発生しました。このウイルスに感染した多くの患者は軽症でしたが、一部の患者では重症化し、中には死亡する人もいました。このような予後の違いは、患者の健康状態だけでなく、ウイルス側の因子も関与していると考えられます。今回、我々は、軽症および重症患者から分離されたウイルスを用い、マウスにおける病原性を比較し、ウイルスの病原性発現因子の同定を試みました。

ウイルスの病原性発現因子を同定することは、インフルエンザウイルスの性状を知るうえで大変重要な課題であると同時に、ワクチンや抗インフルエンザ薬の開発に貢献すると考えられます。

本研究では、A(H1N1)pdm09ウイルスの複製に関わるPB2およびPB1のアミノ酸が病原性発現に関与することを明らかになり、さらに大変興味深いことに、A(H1N1)pdm09ウイルス間の遺伝子組換えにより病原性の強いウイルスが出現する可能性が示唆されました。

概要

安全で呼吸器粘膜にウイルス特異的な抗体を誘導できる新しいワクチンとして、我々は非増殖型ウイルスを基盤としたワクチン開発を行っている。

今回我々は非増殖型ウイルスとして開裂欠損型HAウイルスを作製し、マウスを用いてワクチンとしての性状解析を行った。その結果、開裂欠損型HAウイルスは効率的に液性及び細胞性免疫を誘導することが明らかとなった。また開裂欠損型HAウイルスを投与したマウスは、致死量の野生型ウイルスを感染させても100%生き残った。

以上の成績より、開裂欠損型HAウイルスは、高い免疫誘導能及び防御能を有した優れたワクチンであることが示された。

概要

ウイルスは自らが持つ蛋白質だけでは自己複製出来ないため、増殖には我々の細胞(宿主)の分子が必要です。ウイルス増殖に関わる細胞の分子を明らかにすることは『ウイルスが我々の細胞の中でどうやって増殖しているのか?』という疑問に答えるために必要な、パズルのピース集めのようなものです。本研究で我々は、人間の細胞内でインフルエンザウイルスの蛋白質(NS2)がくっつき、ウイルスが細胞の外に放出される際に必要な分子(F1β)を見つけました。今後、宿主の分子を標的とした抗ウイルス薬の開発が可能なのではないかと期待しています。