発表論文

2013

1. Yamakawa N, Ohto U, Akashi-Takamura S, Takahashi K, Saitoh SI, Tanimura N, Suganami T, Ogawa Y, Shibata T, Shimizu T, Miyake K. Human TLR4 polymorphism D299G/T399I alters TLR4/MD-2 conformation and response to a weak ligand monophosphoryl lipid A. Int. Immunol. 2013, 25:45-52

2. Kanno A, Yamamoto C, Onji M, Fukui R, Saitoh SI, Motoi Y, Shibata T, Matsumoto F, Muta T, Miyake K. Essential role for Toll-like receptor 7 (TLR7)-unique cysteines in an intramolecular disulfide bond, proteolytic cleavage and RNA sensing. International Immunology 2013, 25:413-422

概要：TLR7は核酸認識系TLRの１つであり、生体防御機構に重要な分子です。従来より、TLR7の応答性はRNaseやUnc93 homolog B1(Unc93B1)、cathepsinによって適切に制御されていることが示されています。しかし、内在性TLR7がどのように応答性を制御されているのか解析されていません。また、切断されたTLR7がTLR7応答に重要であることは示唆されていましたが、TLR7が切断されるアミノ酸領域は明らかにされていないため、切断されたN末端側フラグメント（TLR7N）やC末端側フラグメント（TLR7C）の役割は未知のままでした。
そこでまず、我々は内在性TLR7を検出するために、抗マウスTLR7モノクローナル抗体（anti-TLR7 mAb）の作製に取り組み、実用的な抗TLR7抗体としては世界で初めて樹立することに成功しました。さらに、TLR7CをN末端アミノ酸配列解析を行うことによって、TLR7が切断されるアミノ酸領域を決定しました。この解析結果からanti-TLR7 mAbはTLR7Nを認識する抗体であることを見出しました。しかし、anti-TLR7 mAbで内在性TLR7を免疫沈降したところ、TLR7NだけではなくTLR7Cも検出されました。そこで、我々はTLR7NとTLR7Cの結合に関わる要素としてジスルフィド結合の可能性を検討し、非還元処理下によるTLR7検出を行ったところ、切断型TLR7は検出されませんでした。次に我々は、ジスルフィド結合のシステイン残基を精査するために、4つのシステイン残基(C98、C445、C475、C722)を候補として挙げ、これらシステイン残基をセリン残基に置換した変異体(C98S、C445S、C475S、C722S)を作製しました。その結果、C98SおよびC475Sでは切断型TLR7は検出されず、そのTLR7応答も消失しました。また、切断型TLR7とTLR7応答の関連について考察するためにTLR7の切断アミノ酸領域を欠損させた変異型を作製したところ、切断型TLR7は消失し、相関してTLR7リガンド刺激による応答性も欠失することを認めました。したがって、我々はTLR7NとTLR7Cのジスルフィド結合を有したTLR7が細胞外ドメイン領域内で切断され、その切断されたTLR7がTLR7の機能に必須であることを示しました。

3. Tanji H, Ohto U, Shibata T, Miyake K, Shimizu T. Structural Reorganization of the Toll-Like Receptor 8 Dimer Induced by Agonistic Ligands. Science2013, 339:1426-1429

4. Onji M, Kanno A, Saitoh SI, Fukui R, Motoi Y, Shibata T, Matsumoto F, Lamichhane A, Sato S, Kiyono H, Yamamoto K, Miyake K. An essential role for the N-terminal fragment of Toll-like receptor 9 in DNA sensing. Nat. Commun.2013, 4:Article number 1949, doi:10.1038/ncomms2949

概要：Toll様受容体9 (TLR9) は病原体由来のDNAを認識する受容体です．宿主由来の自己DNAに対する不必要な免疫応答を誘起しないために，TLR9は自己DNAに暴露されにくい細胞内にのみ局在し，細胞内器官であるエンドリソソームにおいて細胞外ドメインのN末端フラグメント (TLR9N) が切り離されたTLR9 (TLR9C) のみが下流へシグナルを伝達できると報告されてきました．我々は，新規に作成した抗マウスTLR9抗体の解析によって，脾臓由来の樹状細胞の表面にはTLR9が多く発現することを証明しました．さらにTLR9が切断された後も，TLR9NはTLR9Cと結合していることを証明しました．TLR9を欠損させた樹状細胞に，TLR9C単独ではなくTLR9CとTLR9Nを共発現させた時に初めて，TLR9によるリガンド応答が確認されました．これらの結果から，TLR9が切断された後にTLR9NとTLR9Cが結合した構造体こそがDNAに応答する受容体であることが証明されました．

5. Kawashima T, Kosaka A, Yan H, Guo Z, Uchiyama R, Fukui R, Kaneko D, Kumagai Y, You DJ, Carreras J, Uematsu S, Jang MH, Takeuchi O, Kaisho T, Akira S, Miyake K, Tsutsui H, Saito T, Nishimura I, Tsuji NM. Double-stranded RNA of intestinal commensal but not pathogenic bacteria triggers production of protective interferon-β. Immunity 2013, 38: 1187-97.

6. Miyake K, Onji M. Endocytosis-free DNA sensing by cell surface TLR9 in neutrophils: rapid defense with autoimmune risks. Eur. J. Immunol.2013, 43: 2006-9.

7. Kayagaki N, Wong MT, Stowe IB, Ramani SR, Gonzalez LC, Akashi-Takamura S, Miyake K, Zhang J, Lee WP, Muszyński A, Forsberg LS, Carlson RW, Dixit VM. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science 2013, 341:1246-9.

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2012

1. Ryutaro Fukui and Kensuke Miyake. Controlling systems of nucleic acid sensing-TLRs restrict homeostatic inflammation. Exp. Cell Res. 2012, 318:1461-1466.

2. Shibata T, Takemura N, Motoi Y, Goto Y, Karuppuchamy T, Izawa K, Li X, Akashi-Takamura S, Tanimura N, Kunisawa J, Kiyono H, Akira S, Kitamura T, Kitaura J, Uematsu S, Miyake K. PRAT4A-dependent expression of cell surface TLR5 on neutrophils, classical monocytes and dendritic cells. Int. Immunol. 2012, 24:613-623.

3. Ohto U, Yamakawa N, Akashi-Takamura S, Miyake K, Shimizu T. Structural analyses of human Toll-like receptor 4 polymorphisms D299G and T399I. J Biol Chem.2012, 287:40611-7

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2011

1. Ryutaro Fukui, Shin-Ichiroh Saitoh, Atsuo Kanno, Masahiro Onji, Takuma Shibata, Akihiko Ito, Morikazu Onji, Mitsuru Matsumoto, Shizuo Akira, Nobuaki Yoshida, and Kensuke Miyake. Unc93B1 restricts systemic lethal inflammation by orchestrating TLR7- and TLR9-trafficking. Immunity 2011, 35:1-13.

概要：当研究室では、相反的なTLR7/TLR9バランスが生体内に与える影響を検討するため、Unc93 homolog B1 (Unc93B1)にD34A変異を持つノックインマウス（D34Aマウス）を作製いたしました。このマウスはUnc93B1によるTLR7とTLR9の応答バランス制御が機能しなくなるため、TLR7の応答性が亢進し、TLR9の応答性が減弱いたします。その結果として、脾腫、肝炎、血小板減少など多彩な表現型を自然に呈して死に至ります。
　D34Aマウスの体内ではT細胞が異常に活性化され、ICOSなどの発現増強、Th1およびTh17細胞への分化亢進などが確認されます。このようなT細胞の活性化はB細胞依存的なものであり、成熟B細胞を欠損させたマウスではT細胞の活性化が起こらず、脾腫などの表現型も見られませんでした。これらのことから、TLR7依存的に活性化されたB細胞がT細胞を活性化し、表現型につながっていることが示唆されました。ただし、一部の表現型はB細胞の欠損によっても残ることから、ミエロイド系細胞の影響も考えられます。
　D34Aマウスの解析から「相反的なTLR7/TLR9バランス」の役割を考えますと、内因性の核酸リガンドを基盤とする「自然炎症」を、不可逆的・致死的な段階へ移行させないようにするものであることが示唆されます。今後は詳細な分子メカニズムの解明と、各種表現型に関わる因子の同定に発展させることが重要です。

2. Shibata T, Motoi Y, Tanimura N, Yamakawa N, Akashi-Takamura S, Miyake K. Intracellular TLR4/MD-2 in macrophages senses Gram-negative bacteria and induces a unique set of LPS-dependent genes. Int. Immunol. 2011, 23:503-510.

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2010

1. Hirai M, Kadowaki N, Kitawaki T, Fujita H, Takaori-Kondo A, Fukui R, Miyake K, Maeda T, Kamihira S, Miyachi Y, Uchiyama T. Bortezomib suppresses function and survival of plasmacytoid dendritic cells by targeting intracellular trafficking of Toll-like receptors and endoplasmic reticulum homeostasis. Blood 2010, 117:500-9.

2. Murata A, Okuyama K, Sakano S, Kajiki M, Hirata T, Yagita H, Zúñiga-Pflücker JC, Miyake K, Akashi-Takamura S, Moriwaki S, Niida S, Yoshino M, Hayashi S. A Notch ligand, Delta-like 1 functions as an adhesion molecule for mast cells. J. Immunol. 2010, 185:3905-12.

3. Yamazaki K, Yamazaki T, Taki S, Miyake K, Hayashi T, Ochs HD, Agematsu K. Potentiation of TLR9 responses for human naïve B-cell growth through RP105 signaling. Clin Immunol. 2010, 135:125-136.

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2009

1. Ryutaro Fukui, Shin-ichiro Saitoh, Fumi Matsumoto, Hiroko Kozuka-Hata, Masaaki Oyama, Koichi Tabeta, Bruce Beutler, and Kensuke Miyake. Unc93B1 biases Toll-like receptor responses to nucleic acid in dendritic cells towards DNA- but against RNA-sensing. J. Exp. Med. 2009, 206:1339-1350.

概要：Unc93 homolog B1 (Unc93B1)はTLR3, TLR7, TLR9に結合し、刺激に応じて反応の場に運搬することで、これら核酸認識系TLRの応答性を補完していることが知られています (Tabeta et al., 2006, Brinkmann et al., 2007, Kim et al., 2008)。我々はcDNAライブラリを用いたfunctional cloningの結果、TLR7の応答性を補完する分子としてUnc93 homolog B1 (Ung93B1)を独自に同定いたしました。さらに、Unc93B1の機能部位について精査した結果、34番目のアスパラギン酸を中心とした特定のアミノ酸を変異させることにより、TLR7の応答性が亢進し、TLR9の応答性が減弱することが明らかとなりました。これらは、RNA (TLR7) とDNA (TLR9)に対する応答性がUnc93B1によって相反的に制御されている可能性を示唆しています。
　自己免疫疾患にはTLR7やTLR9が関わっているとの報告がなされていますが、現時点ではTLRの相反的な応答バランス制御という概念は確立されておりません。今回の研究結果は、自然免疫における新概念の確立と、自己免疫疾患発症メカニズムの解明に迫る知見をもたらす可能性があります。

2. Tsukamoto Y, Nagai Y, Kariyone A, Shibata T, Kaisho T, Akira S, Miyake K, Takatsu K. Toll-like receptor 7 cooperates with IL-4 in activated B cells through antigen receptor or CD38 and induces class switch recombination and IgG1 production. Molecular Immunology. 2009, 46:1278-1288.

3. Saitoh S, Miyake K. Regulatory molecules required for nucleotide-sensing Toll-like receptors. Immunological Reviews. 2009, 227:32-43.

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2008

1. Matsumoto F, Saitoh S, Fukui R, Kobayashi T, Tanimura N, Konno K, Kusumoto Y, Akashi-Takamura S, Miyake K. Cathepsins are required for Toll-like receptor 9 responses. Biochem Biophys Res Commun. 2008, 367:693-699.

概要：TLR9の応答に必要な分子の同定を目的として、cDNAライブラリを用いたfunctional cloningを行った。その結果、カテプシンBおよびカテプシンL（Cathepsin B, Cathepsin L）がTLR9の応答に必要な分子であることが明らかとなった。カテプシン阻害剤を用いた実験により、カテプシンはTLR9の細胞内移動ではなくCpG-ODNとの結合に働いていることが示された。なお、カテプシンはTLR9のみならず、TLR3やTLR7といった核酸認識系TLRの応答性にも寄与している。


2. Tanimura N, Saitoh S, Matsumoto F, Akashi-Takamura S, Miyake K. Roles for LPS-dependent interaction and relocation of TLR4 and TRAM in TRIF-signaling. Biochem Biophys Res Commun. 2008, 368:94-99.

3. Kikuchi Y, Koarada S, Nakamura S, Yonemitsu N, Tada Y, Haruta Y, Morito F, Ohta A, Miyake K, Horiuchi T, Nagasawa K. Increase of RP105-lacking activated B cells in the peripheral blood and salivary glands in patients with Sjögren's syndrome. Clin Exp Rheumatol. 2008 6:5-12.

4. Shawkat S, Karima R, Tojo T, Tadakuma H, Saitoh SI, Akashi-Takamura S, Miyake K, Funatsu T, Matsushima K. Visualization of the molecular dynamics of LPS on the plasma membrane of murine macrophages by TIRFM. J. Biol. Chem. 2008.

5. Kobayashi, T., K. Takahashi, Y. Nagai, T. Shibata, M. Otani, S. Izui, S. Akira, Y. Gotoh, H. Kiyono, and K. Miyake. 2008. Tonic B cell activation by Radioprotective105/MD-1 promotes disease progression in MRL/lpr mice. Int. Immunol. 20:881-891.

6. Hiratsuka S, Watanabe A, Sakurai Y, Akashi-Takamura S, Ishibashi S, Miyake K, Shibuya M, Akira S, Aburatani H, Maru Y: The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nat Cell Biol. 2008.

7. Kiyokawa T, Akashi-Takamura S, Shibata T, Matsumoto F, Nishitani C, Kuroki Y, Seto Y, Miyake K: A single base mutation in the PRAT4A gene reveals differential interaction of PRAT4A with Toll-like receptors. Int Immunol. 2008.

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2007

1. Koichiro Takahashi, Takuma Shibata, Sachiko Akashi-Takamura, Takashi Kiyokawa, Yasutaka Wakabayashi, Natsuko Tanimura, Toshihiko Kobayashi, Fumi Matsumoto, Ryutaro Fukui, Taku Kouro, Yoshinori Nagai, Kiyoshi Takatsu, Shin-ichiroh Saitoh, and Kensuke Miyake. A protein associated with Toll-like receptor(TLR)4(PRAT4A) is required for TLR-dependent immune responses. J.Exp.Med. 204: 2963-2976, 2007.

概要：われわれはPRAT4Aのノックアウトマウスを作製した。その結果、１．PRAT4AはTLR4のみならずTLR1,TLR9など他のTLRともERで会合しており、これらTLRのERからのトラフィッキングにはPRAT4Aが必要であること、２．PRAT4AノックアウトマウスではTLR3には影響ないがTLR7,9などの細胞内TLR応答は消失し、TLR1,2,4などの細胞表面TLR応答は部分的に残っている、というように個々のTLRによってPRAT4A依存性が異なることから、PRAT4AはTLR相互の免疫応答バランスを調整していることが考えられること、３．PRAT4Aノックアウトマウスはエンドトキシンショックに抵抗性であることから、エンドトキシンショック誘導にはPRAT4A依存的な経路が必要であること、などが明らかとなった。今後PRAT4Aがエンドトキシンショック治療の新たなターゲットとなる可能性も示唆される。


2. Suganami T, Tanimoto-Koyama K, Nishida J, Itoh M, Yuan X, Mizuarai S, Kotani H, Yamaoka S, Miyake K, Aoe S, Kamei Y, Ogawa Y. Role of the Toll-like receptor 4/NF-kappaB pathway in saturated fatty acid-induced inflammatory changes in the interaction between adipocytes and macrophages. Arterioscler. Thomb. Vasc. Biol. 2007, 27: 84-91.

2. Miyake K. Innate immune sensing of pathogens and danger signals by cell surface Toll-like receptors. Semin Immunol. 2007, 19: 3-10.

4. Ohto U, Fukase K, Miyake K, Satow Y. Crystal structures of human MD-2 and its complex with antiendotoxic lipid IVa. Science 2007, 316:1632-1634.

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2006

1. Yasutaka Wakabayashi, Makiko Kobayashi, Sachiko Akashi-Takamura,Natsuko Tanimura,Kazunori Konno,Koichiro Takahashi, Takashi Ishii, Taketoshi Mizutani, Hideo Iba, Taku Kouro,Satoshi Takaki, Kiyoshi Takatsu, Yoshiya Oda, Yasushi Ishihama, Shin-ichiroh Saitoh, and Kensuke Miyake.A Protein Associated with Toll-like Receptor 4 (PRAT4A) Regulates Cell Surface Expression of TLR41.Journal of Immunology 2006,177:1772-1779.

概要：あらたにみつけたTLR4会合分子、PRAT4AはTLR4のimmature formに会合する40kDの分子である。RNAiによりこの分子の発現を抑制するとTLR4/MD-2の細胞表面での発現が消失しさらにLPS刺激によるNF-ｋBの活性化も見られなくなることから、PRAT4AはTLR4/MD-2の細胞表面への発現を調節している分子であることがわかった。


2.Akashi-Takamura S, Furuta T, Takahashi K, Tanimura N, Kusumoto Y, Kobayashi T, Saitoh S, Adachi Y, Doi T, Miyake K. Agonistic Antibody to TLR4/MD-2 Protects Mice from Acute Lethal Hepatitis Induced by TNF-{alpha}. Journal of Immunology 2006 Apr 1;176(7):4244-51.

概要：作製したTLR4/MD-2に対するモノクローナル抗体のうち、LPS+D-galactosamineによるマウスエンドトキシンショックを抑制するのはLPS刺激抑制抗体ではなくむしろ刺激を増強させる活性化抗体であった。この抗体による抑制効果はTLR4ミュータントマウスではほとんど認められず、TLR4/MD-2を介してアポトーシスを抑制するシグナルを入れている可能性が考えられた。マイクロアレイやRT-PCR,　Northernなどの結果からこの抗体を投与したマウスの肝臓では特異的に抗アポトーシス遺伝子発現上昇が見られ、積極的にこれらの遺伝子発現を誘導していると考えられた。


3.Okamoto M, Oshikawa T, Tano T, Ahmed SU, Kan S, Sasai A, Akashi S, Miyake K, Moriya Y, Ryoma Y, Saito M, Sato M. Mechanism of Anticancer Host Response Induced by OK-432, a Streptococcal Preparation, Mediated by Phagocytosis and Toll-Like Receptor 4 Signaling. J Immunother.;29(1):78-86. 2006.

4.Konno K, Wakabayashi Y, Akashi-Takamura S, Ishii T, Kobayashi M, Takahashi K, Kusumoto Y, Saitoh S, Yoshizawa Y, Miyake K. 2006. A molecule that is associated with Toll-like receptor 4 and regurates its cell surface expression. Biochem Biophys Res Commun. 339(4):1076-1082.

概要：われわれはTLR4のimmature formに会合する分子の同定に成功し, これらの分子を各々PRAT4(PRotein Associated with TLR4)A,　およびPRAT4Bと命名した。どちらも交差することなく独立してTLR4のimmature formに会合し、MD-2とは別にTLR4の細胞表面への発現を調節している分子であることがわかった。


5.Kobayashi M, Saitoh S, Tanimura N, Takahashi K, Kawasaki K, Nishijima M, Fujimoto Y, Fukase K, Akashi-Takamura S, Miyake K: Regulatory roles for MD-2 and TLR4 in ligand-induced receptor clustering. J Immunol. 2006, 176:6211-6218.

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2005

1.Nagai Y, Kobayashi T, Motoi Y, Ishiguro K, Akashi S, Saitoh S, Kusumoto Y, Kaisho T, Akira S, Matsumoto M, Takatsu K, Miyake K. 2005. The Radioprotective 105/MD-1 Complex Links TLR2 and TLR4/MD-2 in Antibody Response to Microbial Membranes. J. Immunol. 174(11):7043-7049.

概要：B細胞表面に発現するRP105/MD-1が、TLR2･TLR4リガンドに代表される細菌表層成分によって誘導される抗体産生を正に制御していることをRP105 KOマウスを用いて明らかにした。RP105の欠損によりB細胞のリポペプチドやLPSへの増殖応答性の低下とプラズマ細胞への分化が阻害される結果、抗体産生の誘導が低下することを明らかにした。


2.Nagaoka K, Takahara K, Tanaka K, Yoshida H, Steinman RM, Saitoh S, Akashi-Takamura S, Miyake K, Kang YS, Park CG, Inaba K. Association of SIGNR1 with TLR4-MD-2 enhances signal transduction by recognition of LPS in gram-negative bacteria. Int Immunol. 2005 Jul;17(7):827-36.

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2004

1.Shin-ichiroh Saitoh, Sachiko Akashi, Takenao Yamada, Natsuko Tanimura, Makiko Kobayashi, Kazunori Konno, Fumi Matsumoto, Koichi Fukase, Shoichi, Kusumoto, Yoshinori Nagai, Yutaka Kusumoto, Atsushi Kosugi, and Kensuke Miyake. 2004. Lipid A Antagonist, Lipid IVa, Is Distinct from Lipid A in Interaction with Toll-like receptor 4 (TLR4)-MD-2 and Ligand-induced TLR4-oligomerization. Int Immunol. 16(7):961-969.

概要：TLR4はLPSを認識してからTLR4同士の多量体を形成することをはじめて生化学的に明 らかにした。このTLR4の多量体の形成がシグナル伝達を開始する上で重要な役割を果たしており、そのアンタゴニストはTLR4に結合するものの多量体を形成させないことで作用していることを明らかにした。


2.Saitoh S, Akashi S, Yamada T, Tanimura N, Matsumoto F, Fukase K, Kusumoto S, Kosugi A, Miyake K. Ligand-dependent Toll-like receptor 4 (TLR4)-oligomerization is directly linked with TLR4-signaling.　J Endotoxin Res. 2004. 10(4):257-60.

3. Iwahashi M, Yamamura M, Aita T, Okamoto A, Ueno A, Ogawa N, Akashi S, Miyake K, Godowski PJ, Makino H. Expression of Toll-like receptor 2 on CD16+ blood monocytes and synovial tissue macrophages in rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum. 2004. 50(5):1457-67.

4. Okamoto M, Oh-EG, Oshikawa T, Furuichi S, Tano T, Ahmed SU, Akashi S, Miyake K, takeuchi O, Akira S, Himeno K, Sato M, Ohkubo S. Toll-like receptor 4 mediates the antitumor host response induced by a 55-kilodalton protein isolated from Aeginetia indica L., a parasitic plant.　Clin Diagn Lab Immunol. 2004. 11(3):483-95.

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