神経グループ

私達は、プロトオンコジーンc-srcの類縁遺伝子fyn及びlynを同定して以来、チロシンキナーゼの発癌・免疫系・神経系における機能を調べてきた。最近は、脳の発生・発達、及び記憶や学習行動における種々のキナーゼの役割に関して研究を行っている（図1）。用いる実験方法は分子細胞生物学の手法を基本としているが、共同研究により発生工学（遺伝子欠損・改変マウス）、行動実験学、電気生理学の手法も広く取り入れている。

1) Src型キナーゼの個体レベルでの役割

Fyn欠損マウスは空間学習脳の低下・恐怖心の昂進などの行動異常に加え、大脳皮質形成の異常・海馬の細胞層構造の乱れなど脳形成における異常を示す。従って、Fynを含めたSrc型キナーゼ（Src型キナーゼ間に機能相補性がある）は脳発生・発達及び記憶など脳高次機能に重要な役割を持っている。私達は、Fynがミエリン形成に重要であることを最初に報告し (Umemori et al., Nature, 1994)、C57BL/6に高度に戻し交配したFyn欠損マウスが水頭症を発症することを見出した (Goto et al., Mol. Cell. Neurosci., 2008)(図2)。またLyn欠損マウスにおける自発行動の低下を示している (Umemori et al., Neurosci., 2003)。これらSrc型キナーゼ欠損マウスの表現型解析を進め、個体レベルでの役割を更に明らかにする研究を推進している。

2) Src型キナーゼの新規標的基質の同定及び機能解析

Fyn欠損マウスの異常は発生・発達期のニューロン、成体マウスでの成熟ニューロン、ミエリン形成を担うオリゴデンドロサイトなど個々の神経系細胞において、個別の活性化因子・標的基質があることを示唆している。しかしSrc型キナーゼの神経系での基質はまだ多くは知られていない。私達は、ファージ発現ライブラリーを用いた固相リン酸化法やyeast two-hybrid法などにより、新規Src型キナーゼ基質を多く同定している (図3、4) (Nakazawa et al., Mol. Biol. Cell, 2003; Liu and Nakazawa et al., J. Biol. Chem., 2006; Yokoyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006; Nakazawa et al., J. Neurochem., 2008; Yokoyama et al., in prep)。またMass解析を用いたプロテオーム手法も導入している(図4) (Hoshina et al., Genes Cells, 2007)。得られた基質は発現細胞・細胞内局在など基本的な情報を得ると共に、個々の分子に応じて（例えば、アクチン骨格制御分子の場合は神経樹状突起・軸索の伸長や形態での寄与）、解析を進める。特にチロシンリン酸化されることにより、酵素活性や局在などその基質の機能がどう変化するかを明らかにする。新規分子に対しては遺伝子欠損マウスの樹立・解析も行っている。

3) NMDA型グルタミン酸受容体チロシンリン酸化の生理的役割

記憶・学習におけるSrc型キナーゼの標的基質として、NMDA型グルタミン酸受容体は私達を含め、多くのグループが注目している。私達はFynによるNMDA受容体サブユニットNR2AとNR2Bのリン酸化残基を決定し(Nakazawa et al., J. Biol. Chem., 2001)、そのチロシン残基をフェニルアラニン（リン酸化されない）に置換した改変マウスを複数樹立した。NR2B Tyr1472改変マウスは扁桃体依存性の行動学習（恐怖条件付け学習）に異常を示した (Nakazawa et al., EMBO J., 2006)。この表現型の裏付けとなる生化学・電気生理学・組織学的解析と合わせて、NMDA受容体チロシンリン酸化の生理的役割の一端を世界で初めて実証した(図5)。他のリン酸化残基改変マウスの解析も進行している (Taniguchi et al., in prep)。

4) BREKキナーゼの神経系における機能解析

最近、脳に高発現している新規キナーゼとしてBREK1を同定した（Kawa et al., Genes Cells, 2004; Kawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006）が、BREK1の神経系における機能は不明な点が多い。私達はBREK1とその類縁キナーゼであるBREK2、及びBREK3の神経系における機能解析を推進している。

5) PTPMEGの機能解析

チロシンキナーゼの重要性はよく理解されてきたが、チロシンリン酸化シグナルを抑制する分子群の神経系における役割、すなわち「チロシンリン酸化が昂進すると脳発生・発達および脳高次機能にどう影響するか」についてはわかっていないことが多い。私達はGluR?2受容体に会合するチロシンフォスファターゼとしてPTPMEGを見出した（Hironaka et al., J. Biol. Chem., 2000）。PTPMEG欠損マウスを作製しPTPMEGの機能解析を行った結果、PTPMEG欠損マウスにおける小脳依存的な学習に異常を見出した（kina et al., Eur. J. Neurosci., 2007）。以上の結果はリン酸化だけでなく、適切な脱リン酸化反応も脳の高次機能に重要であることを示している。

参考文献

神経系におけるSrc型キナーゼの基質分子の同定と解析：
1) Nakazawa et al., Regulation of dendritic spine morphology by an NMDA receptor-associated Rho GTPase-activating protein, p250GAP. J. Neurochem (2008) 105, 1384-1393
2) Hoshina et al., Focal adhesion kinase regulates laminin-induced oligodendroglial process outgrowth. Genes Cells (2007) 12, 1245-1254
3) Yokoyama et al., Phosphorylation at Tyr-694 of Nogo-A by Src-family kinases. Biochem. Biophys. Res. Commun. (2006) 349, 1401-1405
4) Nakazawa et al., NR2B tyrosine phosphorylation modulates fear learning as well as amygdaloid synaptic plasticity. EMBO J. (2006) 25, 2867-2877
5) Liu*, Nakazawa* et al., Physical and functional interaction of Fyn tyrosine kinase with a brain-enriched Rho GTPase-activating protein TCGAP. J. Biol. Chem. (2006) 281, 23611-23619 (*equal contribution)
6) Nakazawa et al., p250GAP, a novel brain-enriched GTPase-activating protein for Rho family GTPases, is involved in the NMDA receptor signaling. Mol. Biol. Cell (2003) 14, 2921-2934
7) Nakazawa et al., Characterization of Fyn-mediated tyrosine phosphorylation sites on GluR?2 (NR2B) subunit of the N-methyl-D-aspartate receptor. J Biol Chem. (2001) 276, 693-699
8) Tezuka et al., PSD-95 promotes Fyn-mediated tyrosine phosphorylation of the N-methyl-D-aspartate receptor subunit NR2A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96, 435-440
9) Hayashi et al., The AMPA receptor interacts with and signals through the protein tyrosine kinase Lyn. Nature (1999) 397, 72-76

Src型キナーゼ欠損マウスの解析：
1) Goto et al., Loss of Fyn tyrosine kinase on the C57BL/6 genetic background causes hydrocephalus with defects in oligodendrocyte development. Mol Cel Neurosci (2008) 38, 203-212
2) Goto et al., Altered gene expression in the adult brain of fyn-deficient mice. Cell. Mol. Neurobiol. (2004) 24, 149-159
3) Umemori et al., Impairment of N-methyl-D-aspartate receptor-controlled motor activity in Lyn-deficient mice. Neurosci . (2003) 118, 709-713
4) Umemori et al., Initial events of myelination involve Fyn tyrosine kinase signaling. Nature (1994) 367, 572-576